羧甲基壳聚糖席夫碱的制备及其抗菌性能研究

[编辑:Cyx]  [发布时间:2015-11-04 15:11:45]  []

申宏杰 董朝红 吕洲 王鹏 李学超
（青岛大学“纤维新材料及现代纺织”国家重点实验室培育基地）

　　摘要：在超声波的作用下，以自制的低分子量羧甲基壳聚糖与香草醛为原料，制备了低分子量羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱。利用FI-IR对其结构进行了表征，研究了香草醛与羧甲基壳聚糖中氨基的反应摩尔比、反应温度、反应时间及超声波功率对产物氨基取代度的影响。结果表明：当香草醛与羧甲基壳聚糖中氨基的摩尔比为1:0.8，反应时间为3h，反应温度为70℃，超声波作用功率为70W时，羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱的氨基取代度可达到82.5%；将羧甲基壳聚糖席夫碱与羧甲基壳聚糖的抗菌性能进行了比较，发现羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱对金黄葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌圈宽度分别比羧甲基壳聚糖的抑菌圈宽0.7mm和0.5mm。
　　前言
　　羧甲基壳聚糖是一种水溶性壳聚糖衍生物，在化妆品、保鲜、医药、功能材料等方面有多种应用，也是近年来研究得较多的壳聚糖衍生物之一。作为生物医用材料，可以应用于伤口贴、包扎带、人造骨骼和人造皮肤以及酶的固定化载体等方面。羧甲基壳聚糖分子中含有-NH₂和-COOH，在水溶液中可以生成-NH₃⁺，因此具有抑菌杀菌功能，其中羧甲基壳聚糖对革兰氏阳性菌的抑制效果要略好于革兰氏阴性菌。羧甲基壳聚糖的许多独特生理活性和功能特性与其分子量大小密切相关，低分子量的羧甲基壳聚糖的抗菌效果更优异。席夫碱（尤其是一些芳香族的席夫碱）基团中由于含有C=N双键而使得席夫碱具有很好的抑菌、杀菌、抗肿瘤等生物活性。将壳聚糖与香草醛进行希夫碱反应制备的壳聚糖香草醛希夫碱，其水溶性不是很好，且反应时间长，获得的氨基取代度较低。
　　本文通过自制的低分子羧甲基壳聚糖与香草醛反应，在超声波的作用下，制备出一种低分子量羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱。该合成产物克服了壳聚糖席夫碱水溶性不好的缺点，在超声波条件下不仅缩短了反应时间，而且提高氨基取代度同时也提高了其抗菌性能，经测试，其对金黄葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌性能均优于羧甲基壳聚糖对金黄葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌性能。
　　1试验部分
　　1.1试验材料、药品和仪器
　　14.75tex×14.75tex，524根/10cm×284根/10cm纯棉漂白布（潍坊齐荣纺织印染有限公司）。
　　低分子量羧甲基壳聚糖（自制，分子量为1.0×104）；香草醛，乙醇，甲基橙，苯胺蓝，氢氧化钠，盐酸，均为国产分析纯；琼脂粉，牛肉浸膏，氯化钠，胰蛋白胨，均为生化试剂。
　　KQ2200DV型数控超声波仪，JJ-1精密增力电动搅拌器，DZF型真空干燥箱，索氏提取器，手提式压力蒸汽灭菌锅（浙江新丰医疗器械有限公司），ZSD-1160型恒温培养箱，ZHWY-2102型恒温摇床，分析天平，5700型傅里叶变换红外光谱仪（美国Nicolet公司）。
　　1.2低分子量羧甲基壳聚糖席夫碱的制备
　　称取一定质量的羧甲基壳聚糖放入到三口烧瓶中，加入适量的乙醇溶液，放入50℃的烘箱中使其溶胀2h。称取一定质量的香草醛加入到适量的乙醇溶液中使其完全溶解，然后加入到盛有已溶胀的羧甲基壳聚糖的三口烧瓶中，将三口烧瓶置于超声波发生器中，在一定的时间、温度和超声波作用下进行震荡搅拌。将反应完成的产物倒入烧杯中，静置倒出上清液，用乙醇洗涤两次，再用乙醇在索氏提取器中提纯24h，最后将析出物放入真空干燥箱中干燥12h得到黄色固体粉末。其反应方程式如图1所示。

　　1.3合成产物的红外表征
　　将羧甲基壳聚糖与所制备的羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱分别与溴化钾按1:100的比例，混合均匀后，进行压片，用Nicolet公司5700型傅里叶变换红外光谱仪测定红外光谱图，测定范围400～4000cm^-1。
　　1.4测试部分
　　1.4.1羧甲基壳聚糖希夫碱氨基取代度的测定
　　取一定质量的反应生成物放置于100mL的锥形瓶中，加入10mL已滴定好的浓度为0.1mol/L的标准盐酸溶液和20mL蒸馏水，静置至完全溶解，加入2滴甲基橙溶液和4滴苯胺蓝，并使用0.1mol/L的标准氢氧化钠溶液滴定至刚刚出现黄绿色即为滴定终点。
　　根据氨基取代度（DS）的公式计算氨基取代度，如式（1）所示。

　　式中，DS为氨基取代度，C₁为标准盐酸溶液的浓度（mol/L），C₂为标准氢氧化钠溶液的浓度（mol/L），V_2样为产物消耗标准氢氧化钠的体积（L），V_2原为羧甲基壳聚糖原样消耗标准氢氧化钠的体积（L），m_原为羧甲基壳聚糖的质量（g），m_样为产物的质量（g）。
　　1.4.2羧甲基壳聚糖席夫碱抗菌性能的测试
　　根据GB/T20944.1-2007《纺织品抗菌性能的评价第1部分：琼脂扩散法》测定。
　　2结果与讨论
　　2.1结构表征
　　图2为羧甲基壳聚糖与羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱的红外光谱图。由图2可以看出，羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱的红外谱图中，1640cm^-1处为C=N的伸缩振动峰。1532cm^-1处为苯环的特征峰，866cm^-1和830cm^-1处为苯环三取代的特征峰。1058cm^-1处为吡喃环的伸缩振动峰，1124cm^-1处为C-O的伸缩振动峰。与羧甲基壳聚糖红外谱图相比，羧甲基壳聚糖席夫碱红外谱图中增加了C=N基团，1083cm^-1处的单峰变化为1124cm^-1和1058cm^-1两个峰值。这是因为由于C=N的影响使得羧甲基壳聚糖基团中的C-O的伸缩振动发生移动。通过这些峰值的判断说明羧甲基壳聚糖与香草醛发生了反应，生成了羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱。

　　2.2反应条件对羧甲基壳聚糖希夫碱氨基取代度的影响
　　2.2.1香草醛与羧甲基壳聚糖的摩尔比对氨基取代度的影响
　　以乙醇为溶剂，温度为70℃，超声波作用功率为70W，反应时间为3h，将香草醛与羧甲基壳聚糖按不同的摩尔比进行反应，通过研究产物氨基取代度，如图3所示。

　　从图3可以看出，香草醛与羧甲基壳聚糖摩尔比小于1:0.8时产物的氨基取代度随着香草醛与羧甲基壳聚糖的摩尔比的增加逐渐增大，当摩尔比1:0.8之后，产物的氨基取代度最大，当摩尔比超过1:0.8后，产物的氨基取代度随着摩尔比的增加变化不大。因此确定香草醛与羧甲基壳聚糖的摩尔比为1:0.8。
　　2.2.2反应时间对产物氨基取代度的影响
　　以乙醇为溶剂，香草醛与羧甲基壳聚糖的摩尔比为1:0.8，反应温度为70℃，超声波功率为70W，研究不同反应时间下对产物氨基取代度的影响，如图4所示。

　　从图4可以看出，氨基取代度在反应时间为1.5-3h内随着的反应时间的延长不断地增加，当反应时间超过3h之后，氨基取代度的变化趋于平衡。这是因为反应时间小于3h时，随着反应时间的延长，羧甲基壳聚糖中氨基上的N原子形成更多的孤对电子，进攻香草醛羰基上带正电的碳原子，使产物的氨基取代度不断升高。而当反应超过3h后，反应物之间的反应达到了平衡，产物随着时间的增加不会发生明显的变化。因此合成的反应时间确定为3h。
　　2.2.3反应温度对产物氨基取代度的影响
　　以乙醇为溶剂，香草醛与羧甲基壳聚糖的摩尔比为1:0.8，在超声波功率为70W，反应时间为3h的条件下，研究反应温度对产物氨基取代度的影响，如图5所示。

　　从图5可以看出，当温度低于70℃时，随着反应温度的升高，产物的氨基取代度不断变大。当反应温度超过70℃之后，氨基取代度趋于平衡。这是因为反应温度低于70℃时，随着反应温度的不断增加，加快氨基中氮原子孤对电子的生成，使这些孤对电子更快地攻击羰基中带正电的碳原子，形成C=N基团，提高了反应速率。当反应温度高于70℃之后，氨基取代度趋于达到最大值。所以确定最佳的反应温度为70℃。
　　2.2.4超声波作用功率对氨基取代度的影响
　　以乙醇为溶剂，香草醛与羧甲基壳聚糖的摩尔比为1:0.8，反应温度为70℃，反应时间为3h，研究不同作用功率对产物氨基取代度的影响，如图6所示。

　　由图6可以看出，在超声波的条件下，产物氨基取代度随着超声波作用功率的增加不断增大。当超声波作用功率为70W时，氨基取代度可达到82.5%。而在不使用超声波的条件下，正常搅拌反应3h后产物氨基的取代度仅为35.7%。这是因为随着超声波作用功率的增加，超声波能量增加，产生空化作用，提高非均相反应的反应速率加快反应物和产物的扩散，促进固体羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱的生成。超声波作用功率的增加，增加了热效应和空化效应，从而使亲核加成反应的速率也随之增加。当超声波功率超过70W之后，产物氨基取代度随着超声波作用功率的增加无明显变化。因此确定超声波的作用功率为70W。
　　2.3羧甲基壳聚糖席夫碱的抗菌性能
　　将羧甲基壳聚糖与羧甲基壳聚糖席夫碱分别配制成质量分数为0.1%的整理液。整理到棉织物上之后进行抗菌，其对大肠埃希菌和金黄葡萄球菌的抑菌圈分别如下图表示。
　　大肠埃希菌的抑菌作用如图7所示：

　　金黄葡萄球菌的抑菌作用如图8所示：

　　从图7、图8可以看出，羧甲基壳聚糖和羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱对大肠埃希菌和金黄葡萄球菌都有很好的抑菌效果，在整理后布样的周围都有抑菌圈，且圈中细菌不再生长。
　　表1为羧甲基壳聚糖与羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱对大肠埃希菌和金黄葡萄球菌抑菌测试结果的评价。

　　由表1可以看出，经羧甲基壳聚糖与羧甲基壳聚糖席夫碱整理的棉织物试样对大肠埃希菌和金黄葡萄球菌的抑菌效果都很好，抑菌带均大于1mm，布样下面均无细菌繁殖。根据GB/T20944.1-2007《纺织品抗菌性能的评价第1部分：琼脂扩散法》可知，当抑菌带大于1mm时表明有很好的抑菌效果，因此，羧甲基壳聚糖与羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱均有很好的抑菌性。通过对羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱与羧甲基壳聚糖的抑菌带进行对比，发现羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱对金黄葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌圈宽度分别比羧甲基壳聚糖的抑菌圈宽0.7mm和0.5mm，因此羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱有更好的抑菌效果。
　　3结论
　　1）以羧甲基壳聚糖和香草醛为原料制备羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱，在超声波作用下，可明显加快反应速度，减少反应时间，提高产物的氨基取代度，降低能耗，是一种快速、环保的制备羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱的方法。
　　2）在超声波作用下，制备羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱的最佳工艺条件为：香草醛与羧甲基壳聚糖的反应摩尔比为1:0.8，温度为70℃，超声波反应时间3h，超声波作用功率为70W。
　　3）羧甲基壳聚糖和羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱整理后纯棉织物对金黄葡萄球菌和大肠埃希菌有很好的抗菌性，抑菌带均大于1mm，且试样下面无细菌的繁殖。羧甲基壳聚糖香草醛席夫碱对金黄葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌带宽度为2.1mm和1.7mm，分别比羧甲基壳聚糖的抑菌圈宽0.7mm和0.5mm，抑菌效果均高于羧甲基壳聚糖。